0公斤、鼠疫菌250公斤、炭疽菌200公斤能力的皮带传送式生产设备，包含监狱的杀人实验所和研究初步细菌战争的机关，以及研究细菌的使用方法的机关等等在内的综合组织体。
以该部队为中心，方圆八公里为半径的范围以内，划为特别地区。以“国境地带取缔法”和“军机保护法”为护符，从该处通往外部的各街道，即在双城街道、拉林街道、平房街道、阿城街道等各街道上，经常有伪警和宪兵严密监视。在这片土地内的23个村，1.2万农民都变成了731部队的奴隶。有440个贫、雇农被撵出村庄，集体关在该队北方附近的“劳工村”，在该队附近的“自养农场”内受奴役。对于其他的农民，则是每天强制出200名劳工和80辆大车以供差役。农民在打骂之下替他们耕种和从事土木工程以及搬运等繁重劳动，生活异常悲惨。
731部队的“血清马”（供采取血清的马）吃燕麦，农民则以吃橡子来苟延残喘。小孩子不断饿死。有个青年因上山拾柴遇到宪兵，说他无许可证，致被打成半死，精神错乱。
1939年5月，日本帝国主义因侵犯苏联哈桑湖边界，挑起哈桑湖事件。原想进窥苏联领土，不料遭到英勇还击，打了败仗。当时的关东军司令官植田谦吉曾派司令部第一课的参谋竹田东宫借查看的名义来到731部队，协商怎样进行细菌战以挽救战局。石井就派遣“碇部队”开往哈桑湖前线，将约有22公斤的伤寒、霍乱、副伤寒、赤痢菌撒布到哈尔哈河及其他水源、地上。当时虽然在日本侵略军中早作出预防的处置，尚且出现大量病人，至于在苏联、蒙古的军队里，在附近的居民中，有多少人受害，这是不难想像的事情。这次散播细菌，是731部队初次大规模的活动。在人类历史上，前所未有的、大规模的、不讲人道的细菌战争，就是这样开始出现的。可以说，731部队是以哈桑湖军事挑衅为转折点，从研究细菌战的准备阶段，进入了实行的阶段。在1944年，石井四郎因从事细菌战争的研究工作，得到日本陆军的最高技术有功奖。
731部队的人员，也在1939到1940年之间骤然增加。哈桑湖事件以前，人数约500名。石井为防止秘密泄露，一向借军医学校的师生关系、亲戚关系和封建隶属关系来维持部队内的团结，掩盖罪恶活动。自从事件发生之后，更招募所谓“青年队”，组成了“子弟兵”，加强他的独裁力量（例如曾招募千叶县不满18岁的青年约70名）。此外，更致力从复员军人以及私人关系中寻求所谓可靠的人。到1942年，部队人员已达2000余名。另一方面，在1938年以后，更把731部队的基干人员，置于中国关内各地的沦陷区内。如设立华北防疫给水部、华中防疫给水部、华南防疫给水部等。东北地区是由1940年起，在牡丹江、林口、孙吴、海拉尔共设立四个支部。1941年，又把大连卫生研究所从“南满洲铁道株式会社”手中，兼并到731部队的管辖下。于是在中国各地，组成了一张细菌战的网，到1940年7月，遂对中国大陆开始了细菌战。
1940年8月，日军731部队根据日军参谋总部、陆军省关于在浙赣沿线城市进行细菌攻击的决定，联合组成了细菌战行动部队——“奈良部队”，以杭州笕桥的原国民党中央航空学校为基地，对浙江等地实施了细菌攻击。井本日记记载：这次攻击的目标有宁波、衢州、金华、玉山、温州、台州、丽水，到10月7日为止共进行了六次细菌攻击，输送细菌26次；温州采用的细菌空投方法是合适的，但须使用降落伞，台州的空投方法不合适；霍乱菌看来不太成功，鼠疫也许是成功的。当时中国地方军政当局明确报告了衢州、宁波和金华受日军细菌战攻击的情况，并进行了防疫工作。日军飞机于10月4日，在衢州县城空投了谷物和鼠疫跳蚤，10月27日又在宁波城区空投了谷物和鼠疫跳蚤，11月27日在金华空投了鼠疫菌液。衢州和宁波相继爆发了鼠疫流行。衢州城乡死亡约2000人以上，并传染到50公里以外的义乌县城，又造成数百人的死亡。宁波城区开明街一带爆发鼠疫流行，虽立即进行了防疫工作，但仍造成106人死亡。金华当时未出现鼠疫流行，表明日军直接空投鼠疫菌液效果不理想，证明了以跳蚤为媒介物是理想的。温州等地可能是空投了霍乱菌，被认为效果不明显。但是，除井本日记所载的飞机空投外，“奈良部队”还多次乘车外出，在河流和水井中撒布细菌。